টু-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির অনেক সুবিধা রয়েছে:
1) নমুনা ভেদ করতে ছোট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের তুলনায় আলোর দীর্ঘতর তরঙ্গদৈর্ঘ্য বিক্ষিপ্তভাবে কম প্রভাবিত হয়;
(2) ফোকাল সমতলের বাইরে ফ্লুরোসেন্ট অণুগুলি উত্তেজিত হয় না যাতে আরও উত্তেজনা আলো ফোকাল সমতলে পৌঁছাতে পারে, যাতে উত্তেজনা আলো নমুনার গভীরে প্রবেশ করতে পারে;
3) কাছাকাছি-ইনফ্রারেড আলোর দীর্ঘতর তরঙ্গদৈর্ঘ্য ছোট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের তুলনায় কোষের জন্য কম বিষাক্ত;
4) একটি নমুনা পর্যবেক্ষণ করার জন্য একটি দুই-ফোটন মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করার সময়, ফটোব্লিচিং এবং ফটোটক্সিসিটি শুধুমাত্র ফোকাল প্লেনে উপস্থিত থাকে। অতএব, দুই-ফোটন মাইক্রোস্কোপগুলি ঘন নমুনাগুলি পর্যবেক্ষণের জন্য, জীবন্ত কোষগুলি পর্যবেক্ষণের জন্য বা স্পট ফটোব্লিচিং পরীক্ষা চালানোর জন্য একক-ফোটন মাইক্রোস্কোপের চেয়ে বেশি উপযুক্ত।
কনফোকাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ জ্ঞান
কনফোকাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের মূল নীতি: একটি বিন্দু আলোর উত্স নমুনাকে বিকিরণ করতে ব্যবহৃত হয়, ফোকাল সমতলে আলোর একটি ছোট, সু-সংজ্ঞায়িত বিন্দু তৈরি করে। বিকিরণের পরে এই বিন্দু থেকে নির্গত ফ্লুরোসেন্সকে উদ্দেশ্যমূলক লেন্স দ্বারা সংগ্রহ করা হয় এবং মূল বিকিরণ আলোর পথ বরাবর একটি দ্বি-দিকীয় ক্রোম্যাটিক মিরর সমন্বিত বিমস্প্লিটারে ফেরত পাঠানো হয়। বিম স্প্লিটার ফ্লুরোসেন্সকে সরাসরি ডিটেক্টরে পাঠায়। আলোর উত্স এবং আবিষ্কারক উভয়েরই সামনে একটি পিনহোল রয়েছে, যাকে যথাক্রমে আলোকসজ্জা পিনহোল এবং সনাক্তকরণ পিনহোল বলা হয়। উভয়েরই একই জ্যামিতি আছে, প্রায় 100-200 এনএম, এবং ফোকাল সমতলে আলোর বিন্দুর সাপেক্ষে একত্রিত হয়, অর্থাৎ, আলোর বিন্দু একাধিক লেন্সের মধ্য দিয়ে যায় এবং শেষ পর্যন্ত আলোকিত উভয়ের উপর ফোকাস করা যায় এবং ডিটেক্টর পিনহোল। এইভাবে, ফোকাল প্লেন থেকে আলো প্রোব অ্যাপারচারের মধ্যে একত্রিত হতে পারে, যখন ফোকাল প্লেনের উপরে বা নীচে থেকে বিক্ষিপ্ত আলো প্রোব অ্যাপারচারের বাইরে অবরুদ্ধ থাকে এবং চিত্রিত করা যায় না। লেজার বিন্দুতে নমুনা বিন্দু স্ক্যান করে এবং পিনহোল শনাক্ত করার পর ফটোমাল্টিপ্লায়ার টিউব বিন্দুতে সংশ্লিষ্ট আলোক বিন্দু বিন্দুর কনফোকাল ইমেজও পায়, যা একটি ডিজিটাল সংকেতে রূপান্তরিত হয় এবং কম্পিউটারে প্রেরণ করা হয় এবং অবশেষে একটি পরিষ্কারে রূপান্তরিত হয়। স্ক্রিনে পুরো ফোকাল প্লেনের কনফোকাল চিত্র।
প্রতিটি ফোকাল প্লেন ইমেজ আসলে নমুনার একটি অপটিক্যাল ক্রস-সেকশন, এবং এই অপটিক্যাল ক্রস-সেকশন সবসময় একটি নির্দিষ্ট বেধ থাকে, এটি একটি অপটিক্যাল শীট নামেও পরিচিত। যেহেতু ফোকাল পয়েন্টে আলোর তীব্রতা নন-ফোকাল পয়েন্টের তুলনায় অনেক বেশি, এবং নন-ফোকাল প্লেন আলো পিনহোল দ্বারা ফিল্টার করা হয়, কনফোকাল সিস্টেমের ক্ষেত্রের গভীরতা শূন্যের কাছাকাছি, এবং স্ক্যানিং Z-অক্ষের দিক বরাবর অপটিক্যাল টমোগ্রাফি ফোকাল স্পট এ পর্যবেক্ষণ করা নমুনার একটি দ্বি-মাত্রিক অপটিক্যাল স্লাইস গঠন করতে সক্ষম করে। Z-অক্ষ (অপটিক্যাল অক্ষ) স্ক্যানিংয়ের সাথে XY সমতল (ফোকাল প্লেন) স্ক্যানিংকে একত্রিত করে, নমুনার একটি ত্রি-মাত্রিক ছবি দ্বি-মাত্রিক চিত্রগুলির পরপর স্তর জমা করে প্রাপ্ত করা যেতে পারে, যা বিশেষ কম্পিউটার সফ্টওয়্যার দ্বারা প্রক্রিয়া করা হয়।
এর অর্থ হল সনাক্তকরণ পিনহোল এবং আলোর উত্স পিনহোল সর্বদা একই বিন্দুতে ফোকাস করা হয়, যাতে ফোকাল প্লেনের বাইরে উত্তেজিত প্রতিপ্রভ সনাক্তকরণ পিনহোলে প্রবেশ করতে না পারে।
লেজার কনফোকালের কাজের নীতিটি সহজভাবে প্রকাশ করা হয় যে এটি ডিজিটাল ইমেজ অধিগ্রহণ এবং প্রক্রিয়াকরণ সিস্টেম পরিচালনা করতে কম্পিউটার নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে ঐতিহ্যগত ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ইমেজিং, অতিরিক্ত লেজার স্ক্যানিং ডিভাইস এবং কনজুগেট ফোকাসিং ডিভাইসের ভিত্তিতে আলোর উত্স হিসাবে লেজার ব্যবহার করে।
