অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপের প্রধান পর্যবেক্ষণ পদ্ধতি হল ফ্লুরোসেন্স পর্যবেক্ষণ
ফ্লুরোসেন্স ঘটনা
ফ্লুরোসেন্স বলতে সেই প্রক্রিয়াকে বোঝায় যেখানে একটি ফ্লুরোসেন্ট পদার্থ একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো দিয়ে বিকিরণ করলে প্রায় একই সাথে দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো নির্গত করে (চিত্র 1)। যখন একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের (উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য) আলো একটি অণুতে আঘাত করে (যেমন একটি ফ্লুরোফোরে একটি অণু), ফোটন শক্তি অণুর ইলেকট্রন দ্বারা শোষিত হয়। এরপরে, ইলেক্ট্রনগুলি স্থল অবস্থা (S0) থেকে উচ্চতর শক্তি স্তরে, উত্তেজিত অবস্থায় (S1') স্থানান্তর করে। এই প্রক্রিয়াটিকে বলা হয় উত্তেজনা①। ইলেকট্রন উত্তেজিত অবস্থায় থাকে 10-9–10-8 সেকেন্ড, এই সময়ে ইলেকট্রন কিছু শক্তি হারায় ②। উত্তেজিত অবস্থা (S1) ছেড়ে স্থল অবস্থায় ফিরে আসার প্রক্রিয়ায় ③, উত্তেজনা প্রক্রিয়া চলাকালীন শোষিত অবশিষ্ট শক্তি মুক্তি পাবে।
উত্তেজিত অবস্থায় একটি ফ্লুরোসেন্ট অণুর বসবাসের সময় হল ফ্লুরোসেন্ট জীবনকাল, সাধারণত ন্যানোসেকেন্ডে, যা ফ্লুরোসেন্ট অণুরই একটি অন্তর্নিহিত বৈশিষ্ট্য। ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইম ব্যবহার করে ইমেজ করার প্রযুক্তিকে ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইম ইমেজিং (এফএলআইএম) বলা হয়, যা আণবিক রূপ, আন্তঃআণবিক মিথস্ক্রিয়া এবং আণবিক মাইক্রোএনভায়রনমেন্ট পেতে ফ্লুরোসেন্স তীব্রতা ইমেজিং ছাড়াও আরও গভীরভাবে কার্যকরী এবং সঠিক পরিমাপ করতে পারে। তথ্য যা প্রচলিত অপটিক্যাল ইমেজিং দ্বারা প্রাপ্ত করা কঠিন।
ফ্লুরোসেন্সের আরেকটি গুরুত্বপূর্ণ বৈশিষ্ট্য হল স্টোকস শিফট, উত্তেজনা এবং নির্গমন শিখরের মধ্যে তরঙ্গদৈর্ঘ্যের পার্থক্য (চিত্র 2)। সাধারণত নির্গমন আলোর তরঙ্গদৈর্ঘ্য উত্তেজনা আলোর তরঙ্গদৈর্ঘ্যের চেয়ে দীর্ঘ হয়। এর কারণ হল ফ্লুরোসেন্ট পদার্থ উত্তেজিত হওয়ার পরে এবং ফোটন নির্গত হওয়ার আগে, ইলেকট্রনগুলি শিথিলকরণ প্রক্রিয়ার মাধ্যমে শক্তির একটি অংশ হারাবে। বৃহত্তর স্টোকস স্থানান্তর সহ ফ্লুরোসেন্ট পদার্থগুলি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের নীচে পর্যবেক্ষণ করা সহজ।
ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার ব্লক
ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি হল একটি অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপ যা পর্যবেক্ষণ এবং চিত্রের জন্য ফ্লুরোসেন্স বৈশিষ্ট্য ব্যবহার করে এবং কোষ জীববিজ্ঞান, নিউরোবায়োলজি, বোটানি, মাইক্রোবায়োলজি, প্যাথলজি, জেনেটিক্স এবং অন্যান্য ক্ষেত্রে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। ফ্লুরোসেন্স ইমেজিংয়ের উচ্চ সংবেদনশীলতা এবং উচ্চ নির্দিষ্টতার সুবিধা রয়েছে এবং টিস্যু এবং কোষে নির্দিষ্ট প্রোটিন, অর্গানেল, ইত্যাদির বিতরণ পর্যবেক্ষণ, সহ-স্থানীয়করণ এবং মিথস্ক্রিয়া অধ্যয়ন, এবং জীবন গতিশীল ট্র্যাকিংয়ের জন্য এটি খুব উপযুক্ত। প্রক্রিয়া যেমন আয়ন ঘনত্ব পরিবর্তন.
কোষের বেশিরভাগ অণু প্রতিপ্রভ হয় না, এবং তাদের দেখতে, তাদের অবশ্যই ফ্লুরোসেন্টলি লেবেল করা উচিত। ফ্লুরোসেন্ট লেবেলিংয়ের অনেক পদ্ধতি রয়েছে, যা সরাসরি লেবেল করা যেতে পারে (যেমন ডিএনএ লেবেল করতে DAPI ব্যবহার করে), বা অ্যান্টিবডিগুলির অ্যান্টিজেন-বাইন্ডিং বৈশিষ্ট্য ব্যবহার করে ইমিউনোস্টেইনিং, বা লক্ষ্য প্রোটিনকে ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন (যেমন GFP, সবুজ) দিয়ে লেবেল করা যেতে পারে। ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিন), বা বিপরীত বাইন্ডিং। সিন্থেটিক রং (যেমন ফুরা-2), ইত্যাদি।
বর্তমানে, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ বিভিন্ন পরীক্ষাগার এবং ইমেজিং প্ল্যাটফর্মের মানক ইমেজিং সরঞ্জাম হয়ে উঠেছে এবং এটি আমাদের দৈনন্দিন পরীক্ষার জন্য একটি ভাল সহায়ক। ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপগুলি প্রধানত তিনটি বিভাগে বিভক্ত: খাড়া ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ (বিভাগ করার জন্য উপযুক্ত), ইনভার্টেড ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ (জীবন্ত কোষের জন্য উপযুক্ত, বিভাগগুলি বিবেচনায় নিয়ে), ফ্লুরোসেন্ট স্টেরিওস্কোপিক মাইক্রোস্কোপ (বৃহত্তর নমুনার জন্য উপযুক্ত, যেমন গাছপালা, আল্ট জেব্রাফ) ভ্রূণ), মেদাকা, মাউস/ইঁদুরের অঙ্গ ইত্যাদি)।
ফ্লুরোসেন্স ফিল্টার ব্লক মাইক্রোস্কোপে ফ্লুরোসেন্স ইমেজিংয়ের মূল উপাদান। এটি একটি উত্তেজনা ফিল্টার, একটি নির্গমন ফিল্টার এবং একটি ডাইক্রোয়িক বিম স্প্লিটার নিয়ে গঠিত। এটি ফিল্টার হুইলে ইনস্টল করা আছে, যেমন Leica DMi8 একটি 6- অবস্থান ফিল্টার চাকা (চিত্র 3) দিয়ে সজ্জিত। ) বিভিন্ন অণুবীক্ষণ যন্ত্রের বিভিন্ন চাকার অবস্থান থাকে এবং কিছু মাইক্রোস্কোপ ফিল্টার স্লাইড ব্যবহার করে।
ফিল্টার ব্লক ফ্লুরোসেন্স ইমেজিংয়ে একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে: উত্তেজনা ফিল্টার নমুনাকে উত্তেজিত করার জন্য উত্তেজনা আলো নির্বাচন করে এবং আলোর অন্যান্য তরঙ্গদৈর্ঘ্যকে ব্লক করে; উত্তেজনা ফিল্টারের মধ্য দিয়ে যাওয়া আলো একটি ডাইক্রোয়িক বিমস্প্লিটারের মধ্য দিয়ে যায় (এর ভূমিকা হল উত্তেজনা আলোকে প্রতিফলিত করা এবং প্রতিপ্রভ প্রেরণ করা), প্রতিফলনের পরে, এটি উদ্দেশ্যমূলক লেন্স দ্বারা ফোকাস করা হয়, নমুনায় বিকিরণ করা হয় এবং সংশ্লিষ্ট প্রতিপ্রভ উত্তেজিত হয় আলো নির্গত করা। নির্গত আলো বস্তুনিষ্ঠ লেন্স দ্বারা সংগ্রহ করা হয়, ডাইক্রোয়িক বিম স্প্লিটারের মধ্য দিয়ে যায় এবং নির্গমন ফিল্টারে পৌঁছায়। চিত্র 4-এ দেখানো হয়েছে: উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য হল 450-490nm, ডাইক্রোয়িক বিম স্প্লিটার 510nm-এর চেয়ে ছোট আলো প্রতিফলিত করে, 510nm-এর চেয়ে দীর্ঘ আলো প্রেরণ করে, এবং নির্গমন আলো গ্রহণের পরিসীমা হল 520-560nm।
সাধারণত ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপে ব্যবহৃত ফ্লুরোসেন্স ফিল্টারগুলিকে দুই প্রকারে ভাগ করা যায়: লং পাস (সংক্ষেপে এলপি) এবং ব্যান্ড পাস (সংক্ষেপে বিপি)। ব্যান্ডপাস সাধারণত কেন্দ্রীয় তরঙ্গদৈর্ঘ্য এবং ব্যবধানের প্রস্থ দ্বারা নির্ধারিত হয়, যেমন 480/40, যার মানে হল যে 460-500nm থেকে আলো পাস করা যেতে পারে। লংপাস ফিল্টার, যেমন 515 LP, 515 এনএম (চিত্র 5) এর চেয়ে বেশি তরঙ্গদৈর্ঘ্যের সাথে আলো পাস করে।
ফ্লুরোসেন্ট পদার্থের তাদের বৈশিষ্ট্যগত উত্তেজনা (শোষণ) বক্ররেখা এবং নির্গমন বক্ররেখা রয়েছে, উত্তেজনার শিখর হল আদর্শ উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য (উচ্চ উত্তেজনা দক্ষতা, যা উত্তেজনা আলোক শক্তি হ্রাস করতে পারে, কোষ এবং রঞ্জকগুলিকে রক্ষা করতে পারে), এবং নির্গমন বক্ররেখা হল নির্গমন ফ্লুরোসেন্স তরঙ্গদৈর্ঘ্য। পরিসীমা অতএব, পরীক্ষায়, আমরা উত্তেজনার জন্য যতটা সম্ভব উত্তেজনা শিখরের কাছাকাছি তরঙ্গদৈর্ঘ্য বেছে নেব এবং প্রাপ্তির পরিসরে নির্গমনের শিখর অন্তর্ভুক্ত করতে হবে। উদাহরণস্বরূপ, অ্যালেক্সা ফ্লুর 488 এর উত্তেজনা শিখর হল 500nm, এবং 480/40 এর উত্তেজনা ফিল্টার ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপে নির্বাচন করা যেতে পারে।
ফিল্টার কিউবগুলির বিশদ বিবরণ মাইক্রোস্কোপ ইমেজিং সফ্টওয়্যারে দেখা যেতে পারে। রঞ্জকগুলি বোঝা এবং আপনার নমুনার সাথে সবচেয়ে ভাল মেলে এমন ফিল্টারটি খুঁজে পাওয়া ফ্লুরোসেন্স ইমেজিংয়ের জন্য গুরুত্বপূর্ণ। ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক এবং ফ্লুরোসেন্ট প্রোটিনের বর্ণালী তথ্য সাধারণত নির্দেশাবলীতে নির্দেশিত হয় এবং অনলাইনেও পাওয়া যেতে পারে।
ফ্লুরোসেন্ট প্রোবের উত্তেজনা এবং নির্গমন তরঙ্গদৈর্ঘ্য ছাড়াও, ফিল্টার ব্লকের নির্বাচনের ক্ষেত্রে অ-নির্দিষ্ট উত্তেজনা আছে কিনা এবং মাল্টিকালার লেবেলযুক্ত নমুনার জন্য ক্রস রঙ আছে কিনা তাও বিবেচনা করতে হবে। উপরন্তু, ব্যবহৃত ফ্লুরোসেন্ট আলোর উৎস বিবেচনা করা প্রয়োজন। বর্তমানে, সাধারণভাবে ব্যবহৃত ফ্লুরোসেন্ট আলোর উত্সগুলির মধ্যে রয়েছে পারদ ল্যাম্প, ধাতব হ্যালাইড ল্যাম্প এবং এলইডি আলোর উত্স যা সাম্প্রতিক বছরগুলিতে দ্রুত বিকাশ লাভ করেছে। একটি ফ্লুরোসেন্ট আলোর উৎসের বর্ণালী অবিচ্ছিন্ন বা অবিচ্ছিন্ন, এবং বিভিন্ন তরঙ্গদৈর্ঘ্য ব্যান্ডে শক্তি ভিন্ন হবে। তুলনামূলকভাবে সংকীর্ণ বর্ণালী ব্যান্ড, আরও স্থিতিশীল শক্তি আউটপুট, দীর্ঘ জীবন, নিরাপদ এবং পরিবেশ সুরক্ষা এবং অন্যান্য অনেক সুবিধার কারণে এলইডি আলোর উত্সটি ধীরে ধীরে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের প্রধান আলোর উত্স হয়ে উঠছে।
মাইক্রোস্কোপের অন্তর্নির্মিত ফিল্টার ব্লক ছাড়াও, একটি বাহ্যিক দ্রুত চাকাও রয়েছে (চিত্র 7)। লাইকার বাহ্যিক দ্রুত চাকা সংলগ্ন ফিল্টারের রূপান্তর গতি হল 27ms, যা উচ্চ-গতির বহু-রঙের পরীক্ষাগুলি উপলব্ধি করতে পারে, যেমন FRET এবং Fura2 অনুপাত ক্যালসিয়াম ইমেজিং। (চিত্র 8) এবং অন্যান্য।
বিভিন্ন ধরণের ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি ইমেজিং কৌশল
বিভিন্ন ফ্লুরোসেন্স ইমেজিং চাহিদা মেটাতে, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ছাড়াও, বিভিন্ন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি ইমেজিং সমাধান তৈরি করা হয়েছে:
ওয়াইড-ফিল্ড হাই-ডেফিনিশন ইমেজিং সিস্টেম, যেমন লাইকা থান্ডার ইমেজার, ইমেজিংয়ের সময় নন-ফোকাল প্লেন হস্তক্ষেপের সংকেতগুলিকে দক্ষতার সাথে অপসারণ করতে, স্পষ্ট চিত্রগুলি উপস্থাপন করে এবং উচ্চ-গতির ইমেজিংয়ের সুবিধাগুলিকে কার্যকরভাবে দূর করতে Leica এর উদ্ভাবনী ক্লিয়ারিং প্রযুক্তি ব্যবহার করে;
কনফোকাল লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ নন-ফোকাল প্লেন হস্তক্ষেপ দূর করতে পিনহোল ব্যবহার করে, অপটিক্যাল সেকশনিং উপলব্ধি করে এবং হাই-ডেফিনিশন ইমেজ এবং ত্রি-মাত্রিক ছবি প্রাপ্ত করে;
আল্ট্রা-হাই-রেজোলিউশন মাইক্রোস্কোপ এবং ন্যানো-অণুবীক্ষণ যন্ত্র যা বিচ্ছুরণ সীমা ভেঙ্গে 200 এনএম-এর চেয়ে ছোট সূক্ষ্ম কাঠামো পর্যবেক্ষণ করতে পারে;
পুরু টিস্যুর ইমেজ করার জন্য মাল্টিফোটন উত্তেজনার নীতি ব্যবহার করে একটি মাল্টিফোটন ইমেজিং সিস্টেম এবং ভিভোর গভীরে;
উচ্চ টেম্পোরাল এবং স্থানিক রেজোলিউশন, দ্রুত ইমেজিং গতি, উচ্চ রেজোলিউশন, কম ফটোটক্সিসিটি সহ হালকা শীট ইমেজিং প্রযুক্তি, বিশেষত উন্নয়ন এবং ভিভো গতিশীল পর্যবেক্ষণে গবেষণার জন্য উপযুক্ত;
ফ্লুরোসেন্স লাইফটাইম ইমেজিং (এফএলআইএম), যা ফ্লুরোসেন্ট পদার্থের ঘনত্ব, ফটোব্লিচিং, উত্তেজনা আলোর তীব্রতা ইত্যাদির মতো কারণ দ্বারা প্রভাবিত হয় না, আরও গভীরভাবে কার্যকরী এবং সঠিক পরিমাপ করতে পারে;
ফ্লুরোসেন্স কোরিলেশন স্পেকট্রোস্কোপি (এফসিএস) এবং ফ্লুরোসেন্স ক্রস কোরিলেশন স্পেকট্রোস্কোপি (এফসিসিএস), ফ্লুরোসেন্ট অণুর আণবিক সংখ্যা এবং প্রসারণ সহগ পরিমাপ করে, যার ফলে আণবিক ঘনত্ব, আণবিক আকার, সান্দ্রতা, আণবিক গতি, আণবিক/অপসিকুলার বৈশিষ্ট্য এবং আণবিক বৈশিষ্ট্য বিশ্লেষণ করে;
টোটাল ইন্টারনাল রিফ্লেকশন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি (টিআইআরএফ), অত্যন্ত উচ্চ জেড-অক্ষ রেজোলিউশন সহ, কোষের ঝিল্লি পৃষ্ঠের আণবিক গঠন এবং গতিবিদ্যা অধ্যয়নের জন্য আদর্শ।
