একটি পোলারাইজিং মাইক্রোস্কোপে পোলারাইজার ক্যালিব্রেট করার জন্য স্ট্যান্ডার্ড পদ্ধতি
ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ সাধারণ অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপ থেকে আলাদা যে এটি সাধারণ আলোর উত্সের আলোকসজ্জার অধীনে নমুনাগুলি পর্যবেক্ষণ করে না। পরিবর্তে, এটি মাইক্রোস্কোপের নীচে নমুনার ভিতরে ফ্লুরোসেন্ট পদার্থগুলিকে উত্তেজিত করতে আলোর একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্য (সাধারণত অতিবেগুনী আলো, নীল বেগুনি আলো) ব্যবহার করে, যার ফলে তারা প্রতিপ্রভ নির্গত করে। অতএব, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপে আলোর উৎসের ভূমিকা সরাসরি আলোকসজ্জা নয়, বরং নমুনার ভিতরে ফ্লুরোসেন্ট পদার্থকে উত্তেজিত করার জন্য একটি শক্তির উৎস হিসেবে। আমরা যে কারণে নমুনাগুলি পর্যবেক্ষণ করতে পারি তা আলোর উত্সের আলোকসজ্জার কারণে নয়, বরং উত্তেজিত আলোক শক্তি শোষণ করার পরে নমুনার ভিতরে ফ্লুরোসেন্ট পদার্থ দ্বারা প্রদর্শিত প্রতিপ্রভ ঘটনা। এটি থেকে, এটি দেখা যায় যে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির বৈশিষ্ট্যটি হল যে এর আলোর উত্স একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের পরিসরে প্রচুর পরিমাণে উত্তেজনা আলো সরবরাহ করতে পারে, যাতে নমুনার ফ্লুরোসেন্ট পদার্থগুলি উত্তেজনা আলোর প্রয়োজনীয় তীব্রতা পেতে পারে। একই সময়ে, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপগুলির অবশ্যই সংশ্লিষ্ট ফিল্টার সিস্টেম থাকতে হবে। ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ হল ফ্লুরোসেন্স টিস্যু রসায়নের একটি মৌলিক হাতিয়ার। এটি একটি অতি-উচ্চ ভোল্টেজ আলোর উত্স, একটি ফিল্টার সিস্টেম (উত্তেজনা এবং দমন ফিল্টার প্লেট সহ), একটি অপটিক্যাল সিস্টেম এবং একটি ফটোগ্রাফি সিস্টেমের মতো প্রধান উপাদানগুলির সমন্বয়ে গঠিত। এটি নমুনাকে উত্তেজিত করতে এবং ফ্লুরোসেন্স নির্গত করতে একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো ব্যবহার করে।
1. ফ্লুরোসেন্স উত্তেজনার পদ্ধতি: আলোর তরঙ্গদৈর্ঘ্যের পরিসর অনুসারে, দুটি প্রকার: UV উত্তেজনা পদ্ধতি (অতিবেগুনী আলোকসজ্জা ব্যবহার করে) এবং BV উত্তেজনা পদ্ধতি (নীল বেগুনি আলো ব্যবহার করে)। UV উত্তেজনা পদ্ধতি উত্তেজনার জন্য 400nm এর চেয়ে ছোট অতিবেগুনী আলো ব্যবহার করে। এই পদ্ধতিতে দৃশ্যমান উত্তেজনা আলো নেই, তাই পর্যবেক্ষণ করা ফ্লুরোসেন্স রঞ্জকের অন্তর্নিহিত ফ্লুরোসেন্স প্রদর্শন করে, যার ফলে ব্যাকগ্রাউন্ড টিস্যুর স্ব-প্রতিপ্রভা থেকে নমুনার নির্দিষ্ট ফ্লুরোসেন্সকে আলাদা করা সহজ হয়।
2. BV উত্তেজনা পদ্ধতি: এতে 404nm এবং 434nm কেন্দ্রিক অতিবেগুনী থেকে নীল আলো পর্যন্ত উত্তেজনা জড়িত। এই পদ্ধতিটি নমুনাকে বিকিরণ করতে নীল আলো ব্যবহার করে, তাই প্রতিপ্রভ পর্যবেক্ষণ সিস্টেমের কাট-ফিল্টারটিকে অবশ্যই এমন একটি ফিল্টার ব্যবহার করতে হবে যা নীল আলোকে সম্পূর্ণরূপে অবরুদ্ধ করতে পারে এবং প্রয়োজনীয় সবুজ এবং হলুদ প্রতিপ্রভের মধ্য দিয়ে যেতে পারে৷ ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি পদ্ধতির জন্য ব্যবহৃত ফ্লুরোসেন্ট রঙ্গক। উত্তেজনা আলোর সর্বাধিক শোষণ তরঙ্গদৈর্ঘ্য এবং ফ্লুরোসেন্সের সর্বাধিক নির্গমন তরঙ্গদৈর্ঘ্য তুলনামূলকভাবে কাছাকাছি, তাই BV উত্তেজনা পদ্ধতিতে ব্যবহৃত ফিল্টারটি অবশ্যই একটি তীক্ষ্ণ কাটা ফিল্টার ব্যবহার করবে। এই পদ্ধতিটি নীল আলোকে উত্তেজনা আলো হিসাবে ব্যবহার করতে পারে, তাই ফ্লুরোসেন্ট রঙ্গকগুলির শোষণের দক্ষতা বেশি এবং উজ্জ্বল চিত্রগুলি পাওয়া যায়। অসুবিধা হল যে 500nm এর নিচে ফ্লুরোসেন্স দেখা যায় না, যখন 500nm এর উপরে ফ্লুরোসেন্স পুরো ইমেজটিকে হলুদ দেখায়। ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি পদ্ধতিতে, নির্দিষ্টতা বেশিরভাগই ফ্লুরোসেন্ট পিগমেন্টের অনন্য রঙ দ্বারা নির্ধারিত হয়, তাই সূক্ষ্ম নির্দিষ্টতা নিয়ে আলোচনা করার সময়, উপরে উল্লিখিত BV উত্তেজনা পদ্ধতির ত্রুটিগুলি প্রায়শই একটি উল্লেখযোগ্য প্রভাব ফেলে।
