ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির নীতি
ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ সাধারণ অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপ থেকে আলাদা। সাধারণ আলোর উত্সগুলির আলোকসজ্জার অধীনে নমুনাগুলি পর্যবেক্ষণ করার পরিবর্তে, তারা একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো (সাধারণত অতিবেগুনী আলো, নীল-বেগুনি আলো) ব্যবহার করে মাইক্রোস্কোপের নীচে নমুনাগুলিতে ফ্লুরোসেন্ট পদার্থগুলিকে উত্তেজিত করতে তাদের প্রতিপ্রভা নির্গত করে। অতএব, একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের আলোর উত্স সরাসরি আলোকসজ্জা হিসাবে কাজ করে না, তবে একটি শক্তির উত্স হিসাবে কাজ করে যা নমুনার মধ্যে ফ্লুরোসেন্ট পদার্থকে উত্তেজিত করে। যে কারণে আমরা নমুনাটি পর্যবেক্ষণ করতে পারি তা হল আলোর উত্সের আলোকসজ্জার কারণে, তবে নমুনায় ফ্লুরোসেন্ট পদার্থের পরে উপস্থাপিত ফ্লুরোসেন্স ঘটনাটি উত্তেজিত আলোক শক্তি শোষণ করে।
এটি দেখা যায় যে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের বৈশিষ্ট্য হল যে এর আলোর উত্স একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের পরিসরে প্রচুর পরিমাণে উত্তেজনা আলো সরবরাহ করতে পারে, যাতে পরীক্ষিত নমুনার ফ্লুরোসেন্ট পদার্থটি প্রয়োজনীয় তীব্রতার উত্তেজনা আলো পেতে পারে। একই সময়ে, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপে অবশ্যই সংশ্লিষ্ট ফিল্টার সিস্টেম থাকতে হবে।
ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি ইমিউনোফ্লোরেসেন্স হিস্টোকেমিস্ট্রির একটি অপরিহার্য হাতিয়ার। এটি অতি-উচ্চ-ভোল্টেজ আলোর উত্স, ফিল্টার সিস্টেম (উত্তেজনা এবং দমন ফিল্টার প্লেট সহ), অপটিক্যাল সিস্টেম এবং ফটোগ্রাফি সিস্টেম এবং অন্যান্য প্রধান উপাদানগুলির সমন্বয়ে গঠিত। এটি ফ্লুরোসেন্স নির্গত করার জন্য নমুনাকে উত্তেজিত করতে একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো ব্যবহার করে।
ফ্লুরোসেন্স উত্তেজিত করার উপায়: আলোর তরঙ্গদৈর্ঘ্যের পরিসর অনুসারে, এটিকে দুই প্রকারে ভাগ করা যায়: UV উত্তেজনা পদ্ধতি (অতিবেগুনী আলো পদ্ধতি ব্যবহার করে) এবং BV উত্তেজনা পদ্ধতি (নীল-বেগুনি আলো ব্যবহার করে)। UV উত্তেজনা পদ্ধতি উত্তেজনার জন্য 400nm এর চেয়ে ছোট কাছাকাছি অতিবেগুনী আলো ব্যবহার করে। এই পদ্ধতিতে কোনও দৃশ্যমান উত্তেজনা আলো নেই, তাই পর্যবেক্ষণ করা ফ্লুরোসেন্স রঞ্জকের অন্তর্নিহিত ফ্লুরোসেন্স উপস্থাপন করে এবং ব্যাকগ্রাউন্ড টিস্যুর অটোফ্লোরোসেন্স থেকে নমুনার নির্দিষ্ট ফ্লুরোসেন্সকে আলাদা করা সহজ।
অতিবেগুনী থেকে নীল আলোতে উত্তেজনার জন্য BV উত্তেজনা পদ্ধতি 404nm এবং 434nm এর উপর ভিত্তি করে। এই পদ্ধতিটি নমুনাকে বিকিরণ করতে নীল আলো ব্যবহার করে, তাই ফ্লুরোসেন্স পর্যবেক্ষণ সিস্টেমের কাট-অফ ফিল্টারটি অবশ্যই এমন একটি ফিল্টার ব্যবহার করতে হবে যা সম্পূর্ণরূপে নীল আলোকে ব্লক করতে পারে এবং প্রয়োজনীয় সবুজ এবং হলুদ প্রতিপ্রভকে সম্পূর্ণভাবে পাস করতে পারে। ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি অ্যাসেসের জন্য ফ্লুরোসেন্ট রঞ্জক। উত্তেজনা আলোর সর্বাধিক শোষণ তরঙ্গদৈর্ঘ্য ফ্লুরোসেন্সের সর্বাধিক নির্গমন তরঙ্গদৈর্ঘ্যের তুলনামূলকভাবে কাছাকাছি, তাই BV উত্তেজনা পদ্ধতিতে ব্যবহৃত ফিল্টারটি অবশ্যই একটি তীক্ষ্ণ কাট-অফ ফিল্টার ব্যবহার করবে। এই পদ্ধতিটি নীল আলোকে উত্তেজনার আলো হিসাবে ব্যবহার করতে পারে, তাই ফ্লুরোসেন্ট পিগমেন্টের শোষণ দক্ষতা বেশি হয় এবং একটি উজ্জ্বল চিত্র পাওয়া যায়। এর অসুবিধা হল যে 500nm এর নিচের ফ্লুরোসেন্স দেখা যায় না এবং 500nm এর উপরে ফ্লুরোসেন্স পুরো ইমেজটিকে হলুদ দেখায়। ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি পদ্ধতিতে, ফ্লুরোক্রোমের নির্দিষ্টতা প্রায়শই ফ্লুরোক্রোমের অনন্য রঙ দ্বারা বিচার করা হয়। অতএব, সূক্ষ্ম নির্দিষ্টতা নিয়ে আলোচনা করার সময়, BV উত্তেজনা পদ্ধতির উপরে উল্লিখিত ত্রুটিগুলি প্রায়শই একটি দুর্দান্ত প্রভাব ফেলে।
সংক্ষেপে, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের আলোকসজ্জা কনডেনসারের গঠন এবং উত্তেজনা আলোর তরঙ্গদৈর্ঘ্য অনুসারে নিম্নলিখিত তিনটি পয়েন্ট অনুসারে বিবেচনা করা যেতে পারে।
① ফ্লুরোসেন্ট চিত্রের বৈপরীত্য প্রয়োজনীয়তার দৃষ্টিকোণ থেকে, আলোকসজ্জার জন্য UV উত্তেজনা অন্ধকার ক্ষেত্রের ঘনীভূতকরণ ব্যবহার করা হয়।
② চিত্রের উজ্জ্বলতা বিবেচনা করে, BV উত্তেজনা ফিল্টারে সর্বোচ্চ অন্ধকার ক্ষেত্রের পর্যবেক্ষণ দক্ষতা রয়েছে।
③UV উত্তেজনা ফিল্টার অন্ধকার ক্ষেত্র পর্যবেক্ষণ এবং BV উত্তেজনা অন্ধকার ক্ষেত্রের ঘনীভূত আলোকসজ্জার বৈশিষ্ট্যগুলিকে এই দুটি আলোকসজ্জা পদ্ধতির মধ্যে হিসাবে বিবেচনা করা যেতে পারে, তবে আগেরটির শক্তিশালী অন্ধকার ক্ষেত্রের বৈশিষ্ট্য রয়েছে এবং উজ্জ্বল চিত্রগুলি প্রদর্শন করে৷ বৈসাদৃশ্য ছোট; পরবর্তীটি অন্ধকার ক্ষেত্রের আলো পথের বৈশিষ্ট্যগুলি ধরে রাখে, তাই প্রদর্শিত চিত্রটি গাঢ় হয় এবং বৈসাদৃশ্য উন্নত হয়। প্রকৃতপক্ষে একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করার সময়, নমুনার প্রয়োজনীয়তার সাথে সবচেয়ে উপযুক্ত আলোকসজ্জা পদ্ধতিটি পর্যবেক্ষণের জন্য ব্যবহার করা উচিত।
এটি অবশ্যই উল্লেখ করা উচিত যে সর্বোত্তম বৈপরীত্য সহ UV-উত্তেজিত অন্ধকার ক্ষেত্রের কনডেন্সারটি আলোকিত হলেও, নমুনা দ্বারা প্রতিসৃত বা বিক্ষিপ্ত অতিবেগুনী উত্তেজনা আলোর অংশটি উদ্দেশ্যমূলক লেন্সে প্রবেশ করবে। অটোফ্লোরেসেন্স ইমেজ প্রতিক্রিয়া খারাপ করতে পারে. অতএব, একটি UV-শোষণকারী ফিল্টার একটি কাট-অফ ফিল্টার হিসাবে আইপিসের সামনে ব্যবহার করা আবশ্যক।
