দুই{{0}ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি সম্পর্কে জ্ঞান
দুটি-ফোটন উত্তেজনার মূল নীতি হল যে উচ্চ ফোটন ঘনত্বে, ফ্লুরোসেন্ট অণুগুলি একই সাথে দুটি দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফোটন শোষণ করতে পারে এবং অল্প সময়ের পরে একটি ছোট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফোটন নির্গত করতে পারে-যাকে উত্তেজিত অবস্থা জীবনকাল বলা হয়; ফ্লুরোসেন্ট অণুগুলিকে উত্তেজিত করার জন্য দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের অর্ধেক তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফোটন ব্যবহার করার মতো প্রভাবটি একই। দুটি ফোটন উত্তেজনার জন্য একটি উচ্চ ফোটন ঘনত্ব প্রয়োজন, এবং ক্ষতিকারক কোষ এড়াতে দুটি-ফোটন মাইক্রোস্কোপি উচ্চ-শক্তি মোড-লক করা পালস লেজার ব্যবহার করে। এই লেজার দ্বারা নির্গত লেজারের উচ্চ শিখর শক্তি এবং নিম্ন গড় শক্তি রয়েছে, যার একটি পালস প্রস্থ মাত্র 100 ফেমটোসেকেন্ড এবং 80 থেকে 100 মেগাহার্টজ পর্যন্ত ফ্রিকোয়েন্সি। একটি উচ্চ সংখ্যাসূচক অ্যাপারচার অবজেক্টিভ লেন্স ব্যবহার করার সময় একটি স্পন্দিত লেজারের ফোটন ফোকাস করার জন্য, অবজেক্টিভ লেন্সের ফোকাল পয়েন্টে ফোটনের ঘনত্ব সবচেয়ে বেশি এবং দুটি{11}}ফোটন উত্তেজনা শুধুমাত্র অবজেক্টিভ লেন্সের ফোকাল পয়েন্টে ঘটে। তাই, দুটি{13}ফটোন মাইক্রোস্কোপের জন্য কনফোকাল পিনহোলের প্রয়োজন হয় না, যা ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণের দক্ষতা উন্নত করে।
সাধারণ ফ্লুরোসেন্স ঘটনাতে, উত্তেজনা আলোর কম ফোটন ঘনত্বের কারণে, একটি ফ্লুরোসেন্ট অণু একটি সময়ে শুধুমাত্র একটি ফোটন শোষণ করতে পারে এবং তারপর বিকিরণীয় স্থানান্তরের মাধ্যমে অন্য ফ্লুরোসেন্ট ফোটন নির্গত করতে পারে, যা একক ফোটন ফ্লুরোসেন্স নামে পরিচিত। আলোর উত্স হিসাবে লেজারগুলি ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স উত্তেজনা প্রক্রিয়ার জন্য, দুটি-ফোটন বা এমনকি মাল্টিফোটন ফ্লুরোসেন্স ঘটনা ঘটতে পারে। এই ক্ষেত্রে, ব্যবহৃত উত্তেজনা আলোর উত্সের উচ্চ তীব্রতা এবং ফোটন ঘনত্ব রয়েছে যা ফ্লুরোসেন্ট অণুর জন্য একই সাথে দুটি ফোটন শোষণের প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে। উত্তেজনা আলোর উত্স হিসাবে একটি সাধারণ লেজার ব্যবহার করার প্রক্রিয়ায়, ফোটনের ঘনত্ব এখনও দুটি-ফোটন শোষণের ঘটনা তৈরি করার জন্য অপর্যাপ্ত। সাধারণত, ফেমটোসেকেন্ড পালস লেজার ব্যবহার করা হয়, তাৎক্ষণিক শক্তি মেগাওয়াট স্তরে পৌঁছে যায়। অতএব, দুই-ফোটন ফ্লুরোসেন্সের তরঙ্গদৈর্ঘ্য উত্তেজনা আলোর চেয়ে ছোট, অর্ধেক উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য উত্তেজনা দ্বারা উত্পাদিত প্রভাবের সমতুল্য।
