ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং সাধারণ হালকা অণুবীক্ষণ যন্ত্রের মধ্যে পার্থক্য
ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপগুলি প্রচলিত অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপ থেকে আলাদা। একটি সাধারণ আলোর উত্স থেকে আলোর সাথে নমুনাগুলি পর্যবেক্ষণ করার পরিবর্তে, তারা মাইক্রোস্কোপের স্লাইডে নমুনার মধ্যে ফ্লুরোসেন্ট পদার্থগুলিকে উত্তেজিত করতে একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের (সাধারণত অতিবেগুনী বা নীল-বেগুনি আলো) আলো ব্যবহার করে, যার ফলে এই পদার্থগুলি ফ্লুরোসেন্স নির্গত করে। অতএব, ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের আলোর উৎস নমুনাকে সরাসরি আলোকিত করে না; এটি নমুনার অন্তঃসত্ত্বা ফ্লুরোসেন্ট পদার্থকে উত্তেজিত করার জন্য শক্তির উৎস হিসেবে কাজ করে। আমরা নমুনাটি আলোর উৎস থেকে আলোকিত হওয়ার কারণে দেখতে পাচ্ছি না, বরং নমুনার অভ্যন্তরে থাকা ফ্লুরোসেন্ট পদার্থ উত্তেজনাপূর্ণ আলোক শক্তিকে শোষণ করে এবং তারপর ফ্লুরোসেন্স নির্গত করে।
এটি অনুসরণ করে যে একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের মূল বৈশিষ্ট্য হল যে এর আলোর উত্স একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্য ব্যান্ডের উত্তেজনা আলো সরবরাহ করতে পারে, যা পরিদর্শন নমুনার মধ্যে ফ্লুরোসেন্ট পদার্থগুলিকে যথেষ্ট তীব্রতার ফ্লুরোসেন্স নির্গত করতে সক্ষম করে। এদিকে, একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ একটি সংশ্লিষ্ট ফিল্টার সিস্টেমের সাথে সজ্জিত করা আবশ্যক। এটি ফ্লুরোসেন্স হিস্টোকেমিস্ট্রির জন্য একটি অপরিহার্য যন্ত্র। একটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ প্রধানত একটি অতি-উচ্চ চাপের আলোর উৎস, একটি ফিল্টার সিস্টেম (উত্তেজনা ফিল্টার এবং বাধা ফিল্টার সহ), একটি অপটিক্যাল সিস্টেম এবং একটি ফটোগ্রাফিক সিস্টেম দ্বারা গঠিত। এটি ফ্লুরোসেন্ট পদার্থকে উত্তেজিত করতে একটি নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো ব্যবহার করে কাজ করে।
① ফ্লুরোসেন্স উত্তেজনার পদ্ধতি উত্তেজনা আলোর তরঙ্গদৈর্ঘ্যের পরিসীমা অনুযায়ী, দুটি প্রকার রয়েছে: UV উত্তেজনা পদ্ধতি (অতিবেগুনী আলোকসজ্জা পদ্ধতি) এবং BV উত্তেজনা পদ্ধতি (নীল-বেগুনি আলোকসজ্জা পদ্ধতি)। UV উত্তেজনা পদ্ধতি 40mn এর চেয়ে কম অতিবেগুনী আলো ব্যবহার করে। এটি অদৃশ্য ফ্লুরোসেন্স তৈরি করে, তাই পর্যবেক্ষণ করা ফ্লুরোসেন্স নমুনা থেকেই আসে। এই পদ্ধতিটি সহজেই ব্যাকগ্রাউন্ডের অটোফ্লুরোসেন্স থেকে নির্দিষ্ট ফ্লুরোসেন্সকে আলাদা করে।
② BV উত্তেজনা পদ্ধতি BV উত্তেজনা পদ্ধতি 404 nm এবং 434 nm কেন্দ্রিক বেগুনি থেকে নীল পর্যন্ত উত্তেজনা আলো ব্যবহার করে। যেহেতু নীল আলো নমুনাকে বিকিরণ করতে ব্যবহার করা হয়, তাই এই পদ্ধতির জন্য উত্তেজনা ফিল্টার সিস্টেমকে অবশ্যই নীল আলোকে সম্পূর্ণরূপে অবরুদ্ধ করতে হবে এবং শুধুমাত্র প্রয়োজনীয় সবুজ এবং হলুদ আলোকে অতিক্রম করার অনুমতি দিতে হবে৷ ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি স্টেনিংয়ের জন্য, উত্তেজনা আলোর সর্বাধিক শোষণ তরঙ্গদৈর্ঘ্য ফ্লুরোসেন্টের সর্বাধিক নির্গমন তরঙ্গদৈর্ঘ্যের কাছাকাছি৷ এই কারণে, BV উত্তেজনার জন্য ফিল্টার সেট একটি কাট-অফ বাধা ফিল্টার ব্যবহার করা আবশ্যক। এই পদ্ধতিটি উত্তেজনার জন্য নীল আলো ব্যবহার করে, তাই ফ্লুরোসেন্স সংগ্রহের দক্ষতা তুলনামূলকভাবে বেশি এবং উজ্জ্বল ছবি পাওয়া যায়। এর অসুবিধা হল যে 500 এনএম এর উপরে ফ্লুরোসেন্স সনাক্ত করা যায় না এবং 500 এনএম এর উপরে শুধুমাত্র হলুদ-সবুজ ছবি দেখা যায়। ফ্লুরোসেন্ট অ্যান্টিবডি স্টেনিংয়ে, নির্দিষ্টতার রায় রঙের তথ্যের উপর অনেক বেশি নির্ভর করে, তাই সূক্ষ্ম নির্দিষ্টতা নিয়ে আলোচনা করার সময় BV উত্তেজনা পদ্ধতির ত্রুটি একটি বড় সীমাবদ্ধতা হতে পারে।
