ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং নরমাল মাইক্রোস্কোপের মধ্যে পার্থক্য

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং নরমাল মাইক্রোস্কোপের মধ্যে পার্থক্য

1. আলো পদ্ধতি তাকান

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের আলোকসজ্জা পদ্ধতিটি সাধারণত এপি-টাইপ হয়, অর্থাৎ আলোর উত্সটি উদ্দেশ্যমূলক লেন্সের মাধ্যমে পরীক্ষার নমুনার উপর স্থাপন করা হয়।

2. রেজোলিউশন দেখুন

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপগুলি আলোর উত্স হিসাবে অতিবেগুনী আলো ব্যবহার করে, তুলনামূলকভাবে ছোট তরঙ্গদৈর্ঘ্যের সাথে, তবে রেজোলিউশন সাধারণ অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপের চেয়ে বেশি।

3, ফিল্টার মধ্যে পার্থক্য

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ দুটি বিশেষ ফিল্টার ব্যবহার করে, দৃশ্যমান আলোকে ফিল্টার করার জন্য আলোর উৎসের সামনে ব্যবহার করা হয় এবং অতিবেগুনী আলোকে ফিল্টার করার জন্য উদ্দেশ্যমূলক লেন্স এবং আইপিসের মধ্যে ব্যবহৃত হয়, যা মানুষের চোখকে রক্ষা করতে পারে।

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপও এক ধরনের অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপ, প্রধানত কারণ ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ দ্বারা উত্তেজিত তরঙ্গদৈর্ঘ্য ছোট, তাই এটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং সাধারণ মাইক্রোস্কোপের গঠন এবং ব্যবহারে পার্থক্যের দিকে পরিচালিত করে। বেশিরভাগ ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের দুর্বল আলো ক্যাপচার করার একটি ভাল কাজ রয়েছে। , তাই অত্যন্ত দুর্বল ফ্লুরোসেন্সের অধীনে, এর ইমেজিং ক্ষমতাও ভাল। সাম্প্রতিক বছরগুলিতে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির ক্রমাগত উন্নতির সাথে সাথে, শব্দও ব্যাপকভাবে হ্রাস পেয়েছে। অতএব, আরও বেশি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করা হয়।

টু-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির জ্ঞান

দ্বি-ফোটন উত্তেজনার মূল নীতি হল: উচ্চ ফোটন ঘনত্বের ক্ষেত্রে, ফ্লুরোসেন্ট অণু একই সময়ে দুটি দীর্ঘ-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফোটন শোষণ করতে পারে এবং খুব অল্প তথাকথিত উত্তেজিত অবস্থার জীবনকাল পরে, একটি স্বল্প-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফোটন নির্গত করে। ; প্রভাবটি ফ্লুরোসেন্ট অণুকে উত্তেজিত করার জন্য তরঙ্গদৈর্ঘ্যের অর্ধেক দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফোটন ব্যবহার করার মতোই। টু-ফোটন উত্তেজনার জন্য উচ্চ ফোটন ঘনত্বের প্রয়োজন হয় এবং কোষের ক্ষতি না করার জন্য, টু-ফোটন মাইক্রোস্কোপি উচ্চ-শক্তি মোড-লকড স্পন্দিত লেজার ব্যবহার করে। এই লেজারটি উচ্চ শিখর শক্তি এবং নিম্ন গড় শক্তি সহ লেজার আলো নির্গত করে, যার পালস প্রস্থ মাত্র 100 ফেমটোসেকেন্ড এবং 80 থেকে 100 মেগাহার্টজ ফ্রিকোয়েন্সি। যখন একটি উচ্চ সংখ্যাসূচক অ্যাপারচার অবজেক্টিভ লেন্স ব্যবহার করা হয় স্পন্দিত লেজারের ফোটন ফোকাস করার জন্য, তখন অবজেক্টিভ লেন্সের ফোকাল পয়েন্টে ফোটনের ঘনত্ব সর্বোচ্চ হয় এবং দুই-ফোটন উত্তেজনা শুধুমাত্র অবজেক্টিভ লেন্সের ফোকাল পয়েন্টে ঘটে। তাই দুই-ফোটন মাইক্রোস্কোপের কনফোকাল পিনহোলের প্রয়োজন নেই, যা ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণ দক্ষতা উন্নত করে।

সাধারণ ফ্লুরোসেন্স প্রপঞ্চে, উত্তেজনা আলোর কম ফোটন ঘনত্বের কারণে, একটি ফ্লুরোসেন্ট অণু একই সময়ে শুধুমাত্র একটি ফোটন শোষণ করতে পারে এবং তারপর বিকিরণ পরিবর্তনের মাধ্যমে একটি ফ্লুরোসেন্ট ফোটন নির্গত করতে পারে, যাকে বলা হয় একক-ফোটন ফ্লুরোসেন্স। আলোর উত্স হিসাবে লেজারের সাথে ফ্লুরোসেন্স উত্তেজনা প্রক্রিয়ার জন্য, টু-ফোটন বা এমনকি মাল্টি-ফোটন ফ্লুরোসেন্স ঘটনা ঘটতে পারে। এই সময়ে, ব্যবহৃত উত্তেজনা আলোর উত্সের তীব্রতা বেশি, এবং ফোটনের ঘনত্ব সেই প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে যে ফ্লুরোসেন্ট অণু একই সময়ে দুটি ফোটন শোষণ করে। উত্তেজনা আলোর উত্স হিসাবে একটি সাধারণ লেজার ব্যবহার করার প্রক্রিয়ায়, ফোটনের ঘনত্ব এখনও দুই-ফোটন শোষণের জন্য যথেষ্ট নয়। সাধারণত, একটি ফেমটোসেকেন্ড স্পন্দিত লেজার ব্যবহার করা হয় এবং এর তাত্ক্ষণিক শক্তি মেগাওয়াটের ক্রম পর্যন্ত পৌঁছাতে পারে। অতএব, দুই-ফোটন ফ্লুরোসেন্সের তরঙ্গদৈর্ঘ্য উত্তেজনা আলোর তরঙ্গদৈর্ঘ্যের চেয়ে ছোট, যা অর্ধ-উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য উত্তেজনা দ্বারা উত্পাদিত প্রভাবের সমতুল্য।

টু-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির অনেক সুবিধা রয়েছে:

1) দীর্ঘ-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো স্বল্প-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলোর চেয়ে বিক্ষিপ্তভাবে কম প্রভাবিত হয় এবং সহজেই নমুনা ভেদ করতে পারে;

2) ফোকাল সমতলের বাইরের ফ্লুরোসেন্ট অণুগুলি উত্তেজিত হয় না, যাতে আরও উত্তেজনা আলো ফোকাল সমতলে পৌঁছাতে পারে, যাতে উত্তেজনা আলো গভীর নমুনাগুলিতে প্রবেশ করতে পারে;

3) দীর্ঘ-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের কাছাকাছি-ইনফ্রারেড আলো স্বল্প-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলোর তুলনায় কোষের জন্য কম বিষাক্ত;

4) দুই-ফোটন মাইক্রোস্কোপির সাহায্যে নমুনা দেখার সময়, ফটোব্লিচিং এবং ফটোটক্সিসিটি শুধুমাত্র ফোকাল প্লেনে উপস্থিত থাকে। অতএব, দুই-ফোটন মাইক্রোস্কোপি একক-ফোটন মাইক্রোস্কোপির চেয়ে মোটা নমুনা দেখার জন্য, জীবন্ত কোষ দেখার জন্য বা স্থির-বিন্দু ফটোব্লিচিং পরীক্ষা-নিরীক্ষা করার জন্য বেশি উপযুক্ত।

কনফোকাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির জ্ঞান

কনফোকাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির মূল নীতি: নমুনাকে আলোকিত করার জন্য একটি বিন্দু আলোর উত্স ব্যবহার করে, ফোকাল সমতলে একটি সুনির্দিষ্ট রূপরেখা সহ একটি ছোট আলোর স্পট তৈরি হয়। বিম স্প্লিটার গঠিত। বিম স্প্লিটার ফ্লুরোসেন্সকে সরাসরি ডিটেক্টরে পাঠায়। আলোর উৎস এবং ডিটেক্টরের সামনে একটি পিনহোল রয়েছে, যাকে যথাক্রমে আলোকসজ্জা পিনহোল এবং সনাক্তকরণ পিনহোল বলা হয়। দুটির জ্যামিতিক মাত্রা একই, প্রায় 100-200 nm; ফোকাল সমতলে আলোর দাগের সাপেক্ষে, দুটিই একত্রিত হয়, অর্থাৎ, আলোক স্থানটি লেন্সের একটি সিরিজের মধ্য দিয়ে যায় এবং অবশেষে একই সময়ে আলোকসজ্জা পিনহোল এবং সনাক্তকরণ পিনহোলের উপর ফোকাস করা যেতে পারে। এইভাবে, ফোকাল সমতল থেকে আলো সনাক্তকরণ গর্তের সীমার মধ্যে ঘনীভূত হতে পারে, যখন ফোকাল প্লেনের উপরে বা নীচের বিক্ষিপ্ত আলো সনাক্তকরণ গর্তের বাইরে অবরুদ্ধ থাকে এবং চিত্রিত করা যায় না। নমুনাটি লেজারের সাহায্যে পয়েন্ট বাই পয়েন্ট স্ক্যান করা হয় এবং ফটোমাল্টিপ্লায়ার টিউব পিনহোল সনাক্ত করার পর সংশ্লিষ্ট আলোক বিন্দু বিন্দুর কনফোকাল ইমেজও বিন্দুতে প্রাপ্ত করে, যা একটি ডিজিটাল সিগন্যালে রূপান্তরিত হয় এবং কম্পিউটারে প্রেরণ করা হয় এবং অবশেষে একত্রিত হয়। পুরো ফোকাল প্লেনের একটি পরিষ্কার কনফোকাল ইমেজে স্ক্রীন। .

প্রতিটি ফোকাল প্লেন ইমেজ আসলে নমুনার একটি অপটিক্যাল ক্রস-সেকশন, এবং এই অপটিক্যাল ক্রস-সেকশনের সবসময় একটি নির্দিষ্ট বেধ থাকে, এটি একটি অপটিক্যাল স্লাইস নামেও পরিচিত। যেহেতু ফোকাল পয়েন্টে আলোর তীব্রতা নন-ফোকাল পয়েন্টের তুলনায় অনেক বেশি, এবং নন-ফোকাল প্লেন আলো পিনহোল দ্বারা ফিল্টার করা হয়, কনফোকাল সিস্টেমের ক্ষেত্রের গভীরতা প্রায় শূন্য, এবং স্ক্যানিং বরাবর জেড-অক্ষ অপটিক্যাল টমোগ্রাফি উপলব্ধি করতে পারে, নমুনার ফোকাসকৃত স্থানে একটি দ্বি-মাত্রিক অপটিক্যাল বিভাগ পর্যবেক্ষণ করে। XY সমতল (ফোকাল প্লেন) স্ক্যানিংকে Z-অক্ষ (অপটিক্যাল অক্ষ) স্ক্যানিংয়ের সাথে একত্রিত করে, ধারাবাহিক স্তরগুলির দ্বি-মাত্রিক চিত্র সংগ্রহ করে এবং বিশেষ কম্পিউটার সফ্টওয়্যার দ্বারা প্রক্রিয়াকরণের মাধ্যমে, নমুনার একটি ত্রিমাত্রিক চিত্র পাওয়া যেতে পারে।

অর্থাৎ, সনাক্তকরণ পিনহোল এবং আলোর উত্স পিনহোল সর্বদা একই বিন্দুতে ফোকাস করা হয়, যাতে ফোকাসিং সমতলের বাইরে উত্তেজিত ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণ পিনহোলে প্রবেশ করতে না পারে।

কনফোকাল লেজারের কাজের নীতির সহজ অভিব্যক্তি হল যে এটি আলোর উত্স হিসাবে একটি লেজার ব্যবহার করে এবং ঐতিহ্যগত ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ইমেজিংয়ের ভিত্তিতে, একটি লেজার স্ক্যানিং ডিভাইস এবং একটি কনজুগেট ফোকাসিং ডিভাইস সংযুক্ত করা হয় এবং ডিজিটাল ইমেজ অধিগ্রহণ এবং প্রক্রিয়াকরণ। সিস্টেম একটি কম্পিউটার দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়।