(দ্বি-ফোটন, কনফোকল) ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং সাধারণ মাইক্রোস্কোপের মধ্যে পার্থক্য
দ্বি-ফোটনের উত্তেজনার মূল নীতিটি হ'ল উচ্চ ফোটনের ঘনত্বে, ফ্লুরোসেন্ট অণু একই সাথে দুটি দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্য ফোটন শোষণ করতে পারে এবং তথাকথিত উত্তেজিত রাষ্ট্রের জীবনকালের স্বল্প সময়ের পরে একটি সংক্ষিপ্ত তরঙ্গদৈর্ঘ্য ফোটন নির্গত করতে পারে; প্রভাবটি ফ্লুরোসেন্ট অণুগুলিকে উত্তেজিত করতে দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের অর্ধেক তরঙ্গদৈর্ঘ্য সহ একটি ফোটন ব্যবহার করার মতো। দুটি ফোটন উত্তেজনার জন্য একটি উচ্চ ফোটনের ঘনত্ব প্রয়োজন এবং ক্ষতিকারক কোষগুলি এড়াতে, দ্বি-ফোটন মাইক্রোস্কোপি উচ্চ-শক্তি মোড-লকড পালস লেজার ব্যবহার করে। এই লেজার দ্বারা নির্গত লেজারের উচ্চ শিখর শক্তি এবং কম গড় শক্তি রয়েছে, যার সাথে ডাল প্রস্থের মাত্র 100 টি ফেমটোসেকেন্ড এবং 80 থেকে 100 মেগাহার্টজ পর্যন্ত ফ্রিকোয়েন্সি রয়েছে। একটি স্পন্দিত লেজারের ফোটনগুলিকে ফোকাস করার জন্য একটি উচ্চ সংখ্যার অ্যাপারচার অবজেক্টিভ লেন্স ব্যবহার করার সময়, উদ্দেশ্য লেন্সের কেন্দ্রবিন্দুতে ফোটনের ঘনত্ব সর্বোচ্চ, এবং দ্বি-ফোটনের উত্তেজনা কেবল উদ্দেশ্য লেন্সের কেন্দ্রবিন্দুতে ঘটে। অতএব, দ্বি-ফোটন মাইক্রোস্কোপের জন্য কনফোকল পিনহোলের প্রয়োজন হয় না, যা ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণের দক্ষতা উন্নত করে।
সাধারণ প্রতিপ্রভ ঘটনায়, উত্তেজনার আলোর কম ফোটনের ঘনত্বের কারণে, একটি ফ্লুরোসেন্ট অণু কেবল একবারে একটি ফোটন শোষণ করতে পারে এবং তারপরে রেডিয়েটিভ ট্রানজিশনের মাধ্যমে অন্য একটি ফ্লুরোসেন্ট ফোটন নির্গত করতে পারে, যা একক ফোটন ফ্লুরোসেন্স হিসাবে পরিচিত। হালকা উত্স হিসাবে লেজারগুলি ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স উত্তেজনা প্রক্রিয়াগুলির জন্য, দ্বি-ফোটন বা এমনকি মাল্টিফোটন ফ্লুরোসেন্সের ঘটনা ঘটতে পারে। এই ক্ষেত্রে, ব্যবহৃত উত্তেজনা আলো উত্সের উচ্চ তীব্রতা এবং ফোটনের ঘনত্ব রয়েছে যা ফ্লুরোসেন্ট অণুগুলির একসাথে দুটি ফোটন শোষণের প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে। উত্তেজনা আলোর উত্স হিসাবে একটি সাধারণ লেজার ব্যবহার করার প্রক্রিয়াতে, ফোটনের ঘনত্ব এখনও দ্বি-ফোটন শোষণ ঘটনাটি উত্পাদন করতে অপর্যাপ্ত। সাধারণত, তাত্ক্ষণিক শক্তি মেগাওয়াট স্তরে পৌঁছানোর সাথে সাথে ফেমটোসেকেন্ড পালস লেজারগুলি ব্যবহার করা হয়। অতএব, দ্বি-ফোটন ফ্লুরোসেন্সের তরঙ্গদৈর্ঘ্য উত্তেজনা আলোর চেয়ে কম, অর্ধ উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্য উত্তেজনা দ্বারা উত্পাদিত প্রভাবের সমতুল্য।
কনফোকল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি সম্পর্কিত জ্ঞান
কনফোকল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির মূল নীতিটি হ'ল ফোকাল প্লেনে একটি সু-সংজ্ঞায়িত ছোট হালকা স্পট গঠন করে নমুনাটিকে বিকিরণ করতে একটি পয়েন্ট আলোর উত্স ব্যবহার করা। বিকিরণের পরে এই স্পট থেকে নির্গত প্রতিপ্রভটি অবজেক্টিভ লেন্স দ্বারা সংগ্রহ করা হয় এবং মূল ইরেডিয়েশন পাথ বরাবর একটি ডাইক্রাইক আয়না দ্বারা গঠিত মরীচি স্প্লিটারে ফিরে প্রেরণ করা হয়। স্পেকট্রোমিটার সরাসরি ডিটেক্টরে ফ্লুরোসেন্স প্রেরণ করে। আলোর উত্স এবং ডিটেক্টর উভয়ের সামনে একটি পিনহোল রয়েছে, যথাক্রমে আলোকসজ্জা পিনহোল এবং সনাক্তকরণ পিনহোল নামে পরিচিত। উভয়ের জ্যামিতিক মাত্রা সামঞ্জস্যপূর্ণ, প্রায় 100-200 nm; ফোকাল প্লেনের হালকা স্পটের সাথে তুলনা করে, দুটিটি কনজুগেট, যার অর্থ হালকা স্পটটি লেন্সের একটি সিরিজের মধ্য দিয়ে যায় এবং শেষ পর্যন্ত আলোকসজ্জা পিনহোল এবং সনাক্তকরণ পিনহোল উভয়কেই একই সাথে ফোকাস করতে পারে। এইভাবে, ফোকাল প্লেন থেকে আলো সনাক্তকরণ গর্তের সীমার মধ্যে রূপান্তর করতে পারে, যখন ফোকাল বিমানের উপরে বা নীচে থেকে ছড়িয়ে ছিটিয়ে থাকা আলো সনাক্তকরণ গর্তের বাইরে অবরুদ্ধ করা হয় এবং চিত্রিত করা যায় না। একটি লেজারের সাহায্যে নমুনা পয়েন্টটি স্ক্যান করা, পিনহোল সনাক্ত করার পরে ফটোমাল্টিপ্লায়ার টিউবটি হালকা স্পট পয়েন্টের সংশ্লিষ্ট কনফোকল চিত্রটি পয়েন্ট দ্বারাও এটি একটি ডিজিটাল সিগন্যালে রূপান্তর করে এবং এটি কম্পিউটারে প্রেরণ করে এবং অবশেষে এটি স্ক্রিনে পুরো ফোকাল বিমানের একটি পরিষ্কার কনফোকাল চিত্রে একত্রিত করে।
