সাধারণ মাইক্রোস্কোপ এবং ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের মধ্যে পার্থক্য

সাধারণ মাইক্রোস্কোপ এবং ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের মধ্যে পার্থক্য

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপগুলি পরিদর্শনের জন্য বস্তুটিকে আলোকিত করার জন্য আলোর উত্স হিসাবে অতিবেগুনী আলো ব্যবহার করে, যাতে বস্তুটি আলো নির্গত করে এবং তারপরে মাইক্রোস্কোপের নীচে বস্তুটিকে পর্যবেক্ষণ করে। এটি প্রধানত ইমিউনোফ্লোরেসেন্স কোষের জন্য ব্যবহৃত হয়। এটি প্রধানত একটি আলোর উৎস, একটি ফিল্টার প্লেট সিস্টেম এবং আইপিস এবং অবজেক্টিভ লেন্সের বিবর্ধনের মাধ্যমে নমুনার ফ্লুরোসেন্ট ইমেজ পর্যবেক্ষণ করার জন্য একটি অপটিক্যাল সিস্টেমের সমন্বয়ে গঠিত। আসুন এই ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং একটি সাধারণ অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপের মধ্যে পার্থক্যটি দেখে নেওয়া যাক।

1. আলো পদ্ধতি পরিপ্রেক্ষিতে

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের আলোকসজ্জা পদ্ধতিটি সাধারণত এপিস্কোপিক হয়, অর্থাৎ, আলোর উত্সটি উদ্দেশ্যমূলক লেন্সের মাধ্যমে পরীক্ষার নমুনায় প্রক্ষেপিত হয়।

2. রেজোলিউশন শর্তাবলী

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপগুলি আলোর উত্স হিসাবে অতিবেগুনী আলো ব্যবহার করে। তরঙ্গদৈর্ঘ্য তুলনামূলকভাবে ছোট, কিন্তু রেজোলিউশন সাধারণ অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপের চেয়ে বেশি।

3. ফিল্টার মধ্যে পার্থক্য

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ দুটি বিশেষ ফিল্টার ব্যবহার করে, যেটি আলোর উৎসের সামনে দৃশ্যমান আলোকে ফিল্টার করার জন্য ব্যবহার করা হয় এবং অতিবেগুনী আলোকে ফিল্টার করার জন্য অবজেক্টিভ লেন্স এবং আইপিসের মধ্যে ব্যবহার করা হয়, যা মানুষের চোখকে রক্ষা করতে পারে।

ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপও এক ধরনের অপটিক্যাল মাইক্রোস্কোপ, প্রধানত কারণ ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ দ্বারা উত্তেজিত তরঙ্গদৈর্ঘ্য ছোট, তাই এটি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ এবং সাধারণ মাইক্রোস্কোপের মধ্যে গঠন এবং ব্যবহারের পার্থক্যের দিকে পরিচালিত করে। বেশিরভাগ ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপগুলির দুর্বল আলো ক্যাপচার করার একটি ভাল কার্যকারিতা রয়েছে, তাই অত্যন্ত দুর্বল ফ্লুরোসেন্সের অধীনে, এর ইমেজিং ক্ষমতাও ভাল। সাম্প্রতিক বছরগুলিতে ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপগুলির ক্রমাগত উন্নতির সাথে সাথে, শব্দটিও ব্যাপকভাবে হ্রাস পেয়েছে। তাই আরও বেশি ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করা হয়।

দুই-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি সম্পর্কে জ্ঞান

দ্বি-ফোটন উত্তেজনার মূল নীতি হল: উচ্চ ফোটন ঘনত্বের ক্ষেত্রে, ফ্লুরোসেন্ট অণু একই সময়ে দুটি দীর্ঘ-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফোটন শোষণ করতে পারে এবং তথাকথিত উত্তেজিত অবস্থার জীবনকালের অল্প সময়ের পরে একটি ছোট-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের ফোটন নির্গত করতে পারে। . ; প্রভাবটি একটি ফোটন ব্যবহার করার মতো যার তরঙ্গদৈর্ঘ্য একটি ফ্লুরোসেন্ট অণুকে উত্তেজিত করার জন্য দীর্ঘ তরঙ্গদৈর্ঘ্যের অর্ধেক। দুই-ফোটন উত্তেজনার জন্য একটি উচ্চ ফোটন ঘনত্ব প্রয়োজন। কোষের ক্ষতি না করার জন্য, দুই-ফোটন মাইক্রোস্কোপি উচ্চ-শক্তি মোড-লক স্পন্দিত লেজার ব্যবহার করে। এই লেজার দ্বারা নির্গত লেজারের উচ্চ শিখর শক্তি এবং নিম্ন গড় শক্তি রয়েছে, এর পালস প্রস্থ মাত্র 100 ফেমটোসেকেন্ড, এবং এর ফ্রিকোয়েন্সি 80 থেকে 100 মেগাহার্টজে পৌঁছাতে পারে। স্পন্দিত লেজারের ফোটন ফোকাস করার জন্য একটি উচ্চ সংখ্যাসূচক অ্যাপারচার অবজেক্টিভ লেন্স ব্যবহার করার সময়, অবজেক্টিভ লেন্সের ফোকাল পয়েন্টে ফোটনের ঘনত্ব সবচেয়ে বেশি হয় এবং দুই-ফোটন উত্তেজনা শুধুমাত্র অবজেক্টিভ লেন্সের ফোকাল পয়েন্টে ঘটে, তাই দুই-ফোটন মাইক্রোস্কোপের একটি কনফোকাল পিনহোলের প্রয়োজন নেই, যা ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণ দক্ষতা উন্নত করে।

সাধারণ ফ্লুরোসেন্স ঘটনাতে, উত্তেজনা আলোর কম ফোটন ঘনত্বের কারণে, একটি ফ্লুরোসেন্ট অণু একই সময়ে শুধুমাত্র একটি ফোটন শোষণ করতে পারে, এবং তারপর একটি বিকিরণীয় পরিবর্তনের মাধ্যমে একটি ফ্লুরোসেন্ট ফোটন নির্গত করতে পারে, যা একক-ফোটন ফ্লুরোসেন্স। আলোর উত্স হিসাবে লেজার ব্যবহার করে ফ্লুরোসেন্স উত্তেজনা প্রক্রিয়ার জন্য, টু-ফোটন বা এমনকি মাল্টি-ফোটন ফ্লুরোসেন্স ঘটতে পারে। এই সময়ে, ব্যবহৃত উত্তেজনা আলোর উত্সের তীব্রতা বেশি, এবং ফোটনের ঘনত্ব একই সময়ে দুটি ফোটন শোষণকারী ফ্লুরোসেন্ট অণুর প্রয়োজনীয়তা পূরণ করে। উত্তেজনা আলোর উত্স হিসাবে একটি সাধারণ লেজার ব্যবহার করার প্রক্রিয়ায়, ফোটনের ঘনত্ব এখনও দুই-ফোটন শোষণের ঘটনা তৈরি করার জন্য যথেষ্ট নয়। সাধারণত, একটি ফেমটোসেকেন্ড স্পন্দিত লেজার ব্যবহার করা হয় এবং এর তাত্ক্ষণিক শক্তি মেগাওয়াটের ক্রম পর্যন্ত পৌঁছাতে পারে। অতএব, দুই-ফোটন ফ্লুরোসেন্সের তরঙ্গদৈর্ঘ্য উত্তেজনা আলোর তরঙ্গদৈর্ঘ্যের চেয়ে ছোট, যা অর্ধেক উত্তেজনা তরঙ্গদৈর্ঘ্যে উত্তেজনা দ্বারা উত্পাদিত প্রভাবের সমতুল্য।

টু-ফোটন ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির অনেক সুবিধা রয়েছে:

1) দীর্ঘ-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলো স্বল্প-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলোর চেয়ে বিক্ষিপ্তভাবে কম প্রভাবিত হয় এবং সহজেই নমুনা ভেদ করে;

2) ফোকাল সমতলের বাইরের ফ্লুরোসেন্ট অণুগুলি উত্তেজিত হয় না, যাতে আরও উত্তেজনা আলো ফোকাল সমতলে পৌঁছাতে পারে, যাতে উত্তেজনা আলো গভীর নমুনাগুলিতে প্রবেশ করতে পারে;

3) দীর্ঘ-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের কাছাকাছি-ইনফ্রারেড আলো স্বল্প-তরঙ্গদৈর্ঘ্যের আলোর তুলনায় কোষের জন্য কম বিষাক্ত;

4) নমুনাগুলি পর্যবেক্ষণ করার জন্য একটি দুই-ফোটন মাইক্রোস্কোপ ব্যবহার করার সময়, ফোকাল প্লেনে ফোকাল ব্লিচিং এবং ফটোটক্সিসিটি ঘটে। অতএব, মোটা নমুনা পর্যবেক্ষণের জন্য, জীবন্ত কোষ পর্যবেক্ষণের জন্য বা স্পট ফটোব্লিচিং পরীক্ষার জন্য একক-ফোটন মাইক্রোস্কোপির চেয়ে টু-ফোটন মাইক্রোস্কোপি বেশি উপযুক্ত।

কনফোকাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপি সম্পর্কে জ্ঞান

কনফোকাল ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপির মূল নীতি: নমুনাকে বিকিরণ করতে একটি বিন্দু আলোর উৎস ব্যবহার করা হয় এবং ফোকাল সমতলে একটি সু-সংজ্ঞায়িত ছোট আলোর স্পট তৈরি হয়। স্প্লিটার দিয়ে গঠিত। বিম স্প্লিটার ফ্লুরোসেন্সকে সরাসরি ডিটেক্টরে পাঠায়। আলোর উৎস এবং ডিটেক্টরের সামনে একটি পিনহোল রয়েছে, যাকে যথাক্রমে আলোকসজ্জা পিনহোল এবং সনাক্তকরণ পিনহোল বলা হয়। দুটির জ্যামিতিক আকার একই, প্রায় 100-200nm; ফোকাল সমতলে আলোর দাগের সাপেক্ষে, দুটিই একত্রিত হয়, অর্থাৎ, আলোক স্থানটি লেন্সের একটি সিরিজের মধ্য দিয়ে যায় এবং অবশেষে একই সময়ে আলোকসজ্জা পিনহোল এবং সনাক্তকরণ পিনহোলের উপর ফোকাস করা যেতে পারে। এইভাবে, ফোকাল সমতল থেকে আলো সনাক্তকরণ গর্তের সুযোগের মধ্যে একত্রিত হতে পারে, যখন ফোকাল প্লেনের উপরে বা নীচে থেকে বিক্ষিপ্ত আলো সনাক্তকরণ গর্তের বাইরে অবরুদ্ধ থাকে এবং চিত্রিত করা যায় না। লেজার বিন্দুতে নমুনা বিন্দু স্ক্যান করে এবং পিনহোল শনাক্ত করার পর ফটোমাল্টিপ্লায়ার টিউব বিন্দুতে সংশ্লিষ্ট আলোক বিন্দু বিন্দুর কনফোকাল ইমেজও পায়, যা একটি ডিজিটাল সংকেতে রূপান্তরিত হয় এবং কম্পিউটারে প্রেরণ করা হয় এবং অবশেষে একত্রিত করে পরিষ্কার করে। স্ক্রিনে পুরো ফোকাল প্লেনের কনফোকাল চিত্র।

প্রতিটি ফোকাল সমতল চিত্র আসলে নমুনার একটি অপটিক্যাল ক্রস-সেকশন। এই অপটিক্যাল ক্রস-সেকশনের সর্বদা একটি নির্দিষ্ট বেধ থাকে, এটি একটি অপটিক্যাল পাতলা বিভাগ হিসাবেও পরিচিত। যেহেতু ফোকাল পয়েন্টে আলোর তীব্রতা নন-ফোকাস পয়েন্টের তুলনায় অনেক বেশি, এবং নন-ফোকাল প্লেন লাইট পিনহোল দ্বারা ফিল্টার করা হয়, কনফোকাল সিস্টেমের ক্ষেত্রের গভীরতা প্রায় শূন্য এবং Z বরাবর স্ক্যান করা হয়। -অক্ষ অপটিক্যাল টমোগ্রাফি উপলব্ধি করতে পারে, নমুনার ফোকাসকৃত স্থানে দ্বি-মাত্রিক অপটিক্যাল বিভাগ পর্যবেক্ষণ করে। Z-অক্ষ (অপটিক্যাল অক্ষ) স্ক্যানিংয়ের সাথে XY সমতল (ফোকাল প্লেন) স্ক্যানিংকে একত্রিত করে, নমুনার ত্রিমাত্রিক চিত্রটি ক্রমাগত স্তরগুলির দ্বি-মাত্রিক চিত্র সংগ্রহ করে এবং বিশেষ কম্পিউটার সফ্টওয়্যার দ্বারা প্রক্রিয়াজাত করে প্রাপ্ত করা যেতে পারে।

অর্থাৎ, সনাক্তকরণ পিনহোল এবং আলোর উত্স পিনহোল সর্বদা একই বিন্দুতে ফোকাস করা হয়, যাতে ফোকাল সমতলের বাইরে উত্তেজিত ফ্লুরোসেন্স সনাক্তকরণ পিনহোলে প্রবেশ করতে না পারে।

লেজার কনফোকালের কার্যকারী নীতির সহজ অভিব্যক্তি হল যে এটি আলোর উত্স হিসাবে লেজার ব্যবহার করে এবং প্রথাগত ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপ ইমেজিংয়ের ভিত্তিতে একটি লেজার স্ক্যানিং ডিভাইস এবং একটি কনজুগেট ফোকাসিং ডিভাইস যোগ করে এবং এটি ডিজিটাল ইমেজ অধিগ্রহণের জন্য একটি সিস্টেম এবং কম্পিউটার নিয়ন্ত্রণের মাধ্যমে প্রক্রিয়াকরণ।